Bradford 법을 이용한 단백질 정량분석pre
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Bradford 법을 이용한 단백질 정량분석pre
Bradford 법을 이용한 단백질 정량분석
Pre-report
학과 : 화학 공학과
학번：200
이름 :
담당교수 : 이
실험날짜 :
1. Title
2010. 3. 24. Bradford 법을 이용한 단백질 정량분석
2. Object
표준 단백질용액(standard protein solution)을 이용하여 단백질 농도 검량선을 작성하고 미시료의 단백질 농도를 측정한다.
3. Reagent and Apparatus
1) 표준 단백질 용액 - BSA (Bovine Serum Albumin) 용액
2) Bradford 시약
3) test tubes
4) A UV/vis spectrophotometer
4. Experimental Procedure
1) Sample 측정
(1) Sample을 1ml 취하여 glass 시험관 혹은 플라스틱제의 sample tube에
넣는다.
(2) 증류수를 1ml 가한다.
(3) Bradford 시약을 0.5ml 가한다.
(4) Vortex mixer로 잘 교반하고 10분 동안 상온에 방치 후
UV/vis spectrophometer로 595nm 에서 측정한다.
2) 검량선 작성
(1) 표준 단백질 용액을 물로 희석하여 표와 같이 각 농도의 용액을 2ml정도
만든다.
(2) 발색시약 0.5ml를 첨가한다.
(3) 595nm의 흡광도를 측정하여 검량선을 작성한다.
최종 BSA 량
[㎍]
표준단백질 용액
[㎖]
water
[㎖]
0
0
2
10
0.5
1.5
20
1
1
30
1.5
0.5
40
2
0
5. Theory
1) 단백질
단백질은 생명체의 구조와 생리 활성을 담당하는 핵심 성분으로 수십 개 이상의 아미노산이 펩티드 결합으로 연결된 구조를 말한다. 단백질은 신체의 구성기능과 에너지를 내는 기능의 두 가지 면에서는 탄수화물이나 지방과 같다. 그러나 단백질은 탄수화물이나 지방 두 영양소와는 달리 신체에서 에너지를 내는데 쓰이지 않는다. 그 대신에 단백질은 체내에 필수적인 중요한 물질들을 만들거나 운반하고, 또는 외부로부터 이물질과 대항해 싸우기도 하며 나아가서는 뼈, 근육과 연결조직을 이루기도 한다. 또 혈액을 응고시키는 데에도 여러가지 종류의 단백질이 필요하다.
2) 단백질 정량
단백질 정량이란 시료 내에 포함된 단백질의 양, 또는 농도를 구하는 과정으로써 대부분의 생화학실험의 기본이 되는 과정이라고 할 수 있다. 생물학 분야의 경우 다른 분야보다 결과를 볼 때 까지 뭔가가 잘못 되었다는 것을 알기 어려워, 준비 단계에서의 단백질 정량이 잘못 이루어지면 헛수고를 하거나 잘못된 결과를 얻을 수 있다. 이러한 이유 때문에 단백질 정량을 정확하게 하는 것은 매우 중요하다. 또한, 정확성 뿐만 아니라, 대부분의 실험에서 반복적으로 사용하게 되므로, 간편성 역시 중요하게 여겨지기 때문에, 실험에 따라서 다양한 단백질 정량 방법이 사용되고 있다.
(1)Bradford
Bradford는 아주 낮은 pH조건이다. 따라서 단백질에 따라 시간이 지날수록 응집이 발생하는 경우가 생길 수 있는데, 이 경우에는 과량의 단백질이 순간적으로 낮은 pH에 노출되면서 나타나는 현상으로 보인다. 그 이유는 total extract는 한 종류만이 아니라 다양한 많은 종류의 단백질들이 섞여 있기 때문으로 단백질 고유의 특성에 의한 응집으로 보기 어렵기 때문이다. 이런 경우엔, 단백질 용액을 약간 희석하여 사용하면 문제가 해결될 수 있다.
산성용액에서 Coomassie brilliantblue 염료는 단백질과 결합하게 되고, 이로 인해 염료의 최대 흡광도(λmax)는 465nm에서 595nm로 이동하게 된다. 따라서 595nm에서의 흡광도는 단백질의 농도와 비례하게 된다. 이 방법은 발색반응 2분 이내에 완결되며, 1시간까지 유지된다. Bradford 방법의 감도는 Lowry 방법보다 좋으며, 미량 정량법을 사용하면 1~20μg의 단백질량을 측정할 수 있다. Bradford방법은 빠를 뿐만 아니라 비단백질 성분들에 의한 방해도 거의 없다.
(2)Lowry
Lowry등이 고안한 이 단백질 정량분석법은 용액에 있는 단백질뿐 아니라 건조된 시료에도 이용될 수 있다. 특히 이 정량방법은 5ug/ml정도의 단백질 양을 정량할 수 있는 대단히 민감한 방법이어서 널리 쓰이고 있다. 이 Lowry 방법에서 사용하는 Folin-Ciocalteau시약에 의한 발색은 뷰렛 시험에서와 마찬가지로 단백질과 알칼리성 구리와의 반응과 포스포몰리브덴산-포스포텅스텐산 염들이 단백질에 있는 티로신과 트립토판 들에 의한 환원반응으로 생긴다. 이 두 아미노산의 함량은 단백질의 종류에 따라서 상당히 다르므로 1mg의 단백질에 대한 색의 세기가 일정하지가 않다. 표준곡선을 결정하는 데 사용한 단백질이 나타내는 색의 세기와 다를 수 있다. 그럼에도 불구하고 이 방법은 단백질을 정제하는 과정에 있어서 단백질의 함량변화를 측정하는 데는 매우 유용한 방법이다.
(3) UV spectrum
단백질 용액의 흡광도를 분광광도계로 측정하는 방법이다. 단백질에 있는 tyrosine, phenylalanine 및 tryptophan 잔기들은 각각 275nm와 280nm의 자외선을 흡수한다. 많은 단백질들에 있어서의 이 아미노산들의 합친 수준은 거의 일정하므로 단백질의 농도는 280nm에서의 흡광도와 비례하게 되는데, 이것을 이용하여 단백질을 정량하는 방법이다. 측정범위가 0.1~1mg/ml 정도로 화학적 반응이 없기 때문에 간단하게 sample의 회수가 가능하고 정량하는 데 시간이 적게 들며, 순수한 단백질의 농도는 280nm에서 흡광도를 측정함으로써 신속히 결정할 수 있다는 장점을 갖고 있다.
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자료출처 : http://www.ALLReport.co.kr/search/detail.asp?pk=11006815&sid=ddangkung&key=
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